Interacción de compuestos antitumorales con la membrana plasmática

Contrato de colaboración para I+D PharmaMar. Estudio de las interacciones de Irvalec® en célula viva.

Utilizando métodos de transferencia de energía resonante FLIM-FRET con análisis de fasores (FLIM-phasor), hemos estudiado la interacción del compuesto antitumoral Irvalec® con componentes de la membrana plasmática. Irvalec marcado con OG-488 (Irv-OG488) e Irvalec marcado con A-555 (Irv-A555) son, respectivamente, donador y aceptor en este estudio FRET.

En la imagen FLIM-FRET de células A549 tratadas con una mezcla de Irv-OG488 (donador), Irv-A555 (aceptor) e Irvalec frio podemos ver cómo la vida media del donador en la membrana disminuye por efecto de la presencia del aceptor, sugiriendo la existencia de FRET (figura de la izquierda, canal donador, I y II). Las moléculas de Irvalec se localizan en la membrana plasmática, suficientemente cerca como para sugerir que autoasocian, formando estructuras supramoleculares que probablemente inician la muerte celular por necrosis, a través de la ruptura de la membrana plasmática.

Imágenes FLIM-FRET de células A549 tratadas con 0.6 mM Irv-OG488, 1.8 mM Irv-A555 y 2.4 mM Irvalec. I (sección XY, Z = 0) y II (sección YZ, posición X definida por la flecha blanca de I): canal del donador (OG488). III (sección XY, Z = 0) y IV (sección YZ, posición X definida por la flecha blanca de III): canal del aceptor (A555). Filtro del canal del donador: FF01 520/35. Filtro del canal del aceptor: FF01 685/40. Dicróico: FF560-Di01. Escala tipo rainbow de vida media entre 1.5 y 3.5 ns. Barra de escala: 10 mm.		Estudio comparativo de la interacción de Irvalec con la membrana plasmática de células HCT-116 (sensibles) y HCT-116-Irv (resistentes a Irvalec). Imágenes representativas de Intensidad de fluorescencia (A, D, G), FLIM-phasor (B, E, H) y phasor plot (C, F, I). Fila 1: células HCT-116 sin tratar. Los phasores correspondientes a la autofluorescencia se marcan con un cursor gris en el phasor plot, de manera que los píxeles correspondientes a esos phasores aparecen en color gris en la imagen FLIM-phasor. Fila 2: células HCT-116-Irv tratadas con un total de 5 μM de Irvalec (donor FRET Irv-OG488 200 nM, aceptor FRET Irv-A555 800 nM, Irvalec sin marcar 3 μM, 1:4:15). Los phasores correspondientes al donador solo (Irv-OG488) se marcan con un cursor verde en el phasor plot, de manera que los píxeles correspondientes a esos phasores aparecen en color verde en la imagen FLIM-phasor. Fila 3: células HCT-116 tratadas con un total de 4 μM de Irvalec (donor FRET Irv-OG488 200 nM, aceptor FRET Irv-A555 800 nM, Irvalec frío 3 μM, 1:4:15). Los phasores correspondientes al donador en presencia de aceptor (FRET) se marcan con un cursor rosa en el phasor plot, de manera que los píxeles correspondientes a esos phasores aparecen en color rosa en la imagen FLIM-phasor. λexc=755 nm (80 MHz); λem=520/35 nm; T=37ºC.

El método de phasores es una herramienta que permite interpretar de forma directa la señal de intensidad de fluorescencia recogida en una imagen FLIM sin realizar ningún ajuste: el decaimiento de intensidad de fluorescencia de cada pixel se transforma en un punto con un par de coordenadas que se corresponden con la fase y el módulo de un vector, llamado phasor. Los phasores de todos los píxeles de una imagen dan lugar a un histograma bidimensional (phasor plot o diagrama de phasores) en el que cada pixel se corresponde con un punto que tiene una posición única, independientemente del número de exponenciales necesarias para ajustar su decaimiento, y viceversa, cada punto del diagrama de phasores está asociado a un pixel de la imagen (imagen FLIM-phasor o imagen de phasores). Por tanto, este método permite identificar espacialmente especies moleculares por su vida media de forma gráfica, sin tener que resolver ajustes complejos. También permite hacer estudios FRET, tanto desde el canal del donador como desde el canal del aceptor.

En la figura de la derecha se muestra el análisis de phasores del estudio comparativo de la interacción de Irvalec con la membrana plasmática en células sensibles (HCT-116) y resistentes a Irvalec (HCT-116-Irv). Es un método cuantitativo y simple que permite comparar dos tipos celulares en términos de vida media del donador en ausencia de aceptor (τ_D), vida media del donador en presencia de aceptor (FRET, τ_DA) y eficiencias FRET. De forma gráfica, marcamos con cursores las posiciones de los phasores correspondientes a la autofluorescencia (cursor gris) y donador en ausencia de aceptor (cursor verde).

El método de phasores permite distinguir si dos especies interaccionan o no de forma gráfica: los phasores que describen todas las posibles mezclas de dos especies que no interaccionan entre sí se encuentran sobre una línea recta que une las posiciones de las dos especies individuales. Sin embargo, si esas dos especies interaccionan entre sí como un par FRET, los phasores que describen la interacción se separan de esa línea recta y aparecen sobre una trayectoria circular. Cualquier disminución de la vida media del donador debida a un aumento de la AF situaría el phasor correspondiente en algún punto de la línea que une las especies donador y AF, pero si la disminución se debe a FRET, el phasor aparecerá sobre una trayectoria circular que se desplaza hacia la derecha respecto de esta línea.

En células tratadas resistentes a Irvalec (figura derecha, fila 2) podemos ver las moleculas de donador no afectadas por la presencia del aceptor y situadas en el exterior celular (color verde), indicando que Irvalec no ha entrado en el interior celular. La vida media en el interior celular no ha cambiado sustancialmente respecto a las células no tratadas (fila 1), mostrando el comportamiento típico de la autofluorescencia (color gris). En células tratadas sensibles a Irvalec (fila 3), podemos ver que Irvalec sí ha penetrado en el interior celular pero sin que se produzcan fenómenos FRET (color verde). Sin embargo, hay un grupo de phasores que aparecen desplazados a la derecha de la línea donador-AF en los que se ha producido una disminución de la vida media del donador en presencia del aceptor debida a FRET (cursor rosa). Estos phasores corresponden a píxeles localizados en la membrana plasmática.

El análisis FLIM-FRET por el método de phasores confirma que las moléculas de Irvalec están formando algún tipo de ensamblaje en la membrana plasmática de células HCT-116 sensibles, un efecto que precede a la destrucción de la integridad de la membrana. Sin embargo, este compuesto no es capaz de penetrar en el interior ni es capaz de formar este tipo de estructuras en la membrana de células resistentes.