Organización 3D, dinámica y estequiometrías en homo- y hetero-asociaciones

Colaboración Dr. A.Felipe (Univ. Barcelona)

Kv1.3 es una proteína tetramérica de membrana que forma un canal que conduce iones K⁺ a través de la membrana celular, en respuesta a cambios de voltaje en la membrana. Recientemente se ha propuesto que Kv1.3 interacciona con la proteína reguladora KCNE4 con estequiometria desconocida.

Hemos estudiado la homoasociación de Kv1.3 y su interacción con la proteína reguladora KCNE4, utilizando métodos de homo-FRET/imágenes de anisotropía de fluorescencia y FLIM-FRET, combinados con el método de fasores, en células vivas HEK293 transfectadas, que expresaban las proteínas de interés marcadas con las proteínas fluorescentes EGFP, mApple y mCherry.

Imágenes de vidas medias de fluorescencia (<τ>; FLIM) y de anisotropía de fluorescencia (r) de una célula HEK293 representativa, que expresa Kv1.3-EGFP o una mezcla de Kv1.3-EGFP/Kv1.3. λexc=850 nm (82MHz); λem=520/35 nm; T=37ºC.

En la figura se comparan las imágenes de vidas medias y de anisotropía de fluorescencia de una célula HEK293 representativa y de un detalle de su membrana. Se observa un aumento de la anisotropía de fluorescencia cuando la célula expresa una mezcla de Kv1.3-EGFP y Kv1.3, debido a la disminución del homo-FRET por la presencia de moléculas de Kv1.3 sin marcar en los complejos [Kv1.3]₄.

Utilizando el complejo [Kv1.3-EGFP]₄ como control de homo-FRET y hetero-FRET, hemos podido caracterizar el complejo [Kv1.3]-[KCNE4] y determinar su estequiometria.