FCS
La difusión lateral, las interacciones de biomoléculas y estequimetría de complejos se pueden estudiar utilizando la Espectroscopía de Correlación de Fluorescencia (FCS), que mide los coeficientes de difusión traslacional mediante el análisis de la función de autocorrelación de las fluctuaciones de intensidad de fluorescencia de un grupo muy pequeño de fluoróforos capaces de difundir que se encuentran en el volumen confocal (0.1-0.2 μm3).
|
FCSLa difusión lateral, las interacciones de biomoléculas y estequimetría de complejos se pueden estudiar utilizando la Espectroscopía de Correlación de Fluorescencia (FCS), que mide los coeficientes de difusión traslacional mediante el análisis de la función de autocorrelación de las fluctuaciones de intensidad de fluorescencia de un grupo muy pequeño de fluoróforos capaces de difundir que se encuentran en el volumen confocal (0.1-0.2 μm3).
|
FLIM Y FLIM-PhasorLa microscopía de imágenes de vidas medias de fluorescencia (FLIM) se basa en que la vida media de fluorescencia de un fluoróforo (τ) depende de su microentorno, pero no de su concentración, lo que hace que se pueda estudiar el comportamiento de una molécula independientemente de esta variable, normalmente desconocida. Los píxeles de las imágenes FLIM contienen los decaimientos de intensidad de fluorescencia ajustados a una función multiexponencial correspondiente a las especies moleculares presentes en el interior celular. El método de phasores (FLIM-Phasor) es una herramienta que permite interpretar de forma gráfica la señal de fluorescencia de las imágenes FLIM sin realizar ajustes. |
FRET, FLIM-FRET y FLIM-FRET-PhasorLa Transferencia de Energía Resonante tipo Förster (FRET) es una herramienta muy usada en el estudio de las interacciones moleculares en biología celular. La detección de FRET por FLIM, FLIM‐FRET, es la aplicación más frecuente de la microscopía de imágenes de vidas medias, FLIM. En una imagen FLIM‐FRET es posible diferenciar espacialmente regiones FRET por el descenso en la vida media del donador. El método de phasores también se puede aplicar a estudios FRET (FLIM-FRET-Phasor).
|
TR-AIMLa microscopía de imágenes de anisotropía de fluorescencia (TR-AIM) proporciona información inestimable para comprender la dinámica de proteínas con resolución espacial. Los movimientos rotacionales y segmentarios de las proteínas pueden caracterizarse midiendo la anisotropía de fluorescencia de los fluoróforos unidos a las biomoléculas. La molécula fluorescente excitada con luz linealmente polarizada que está rotando, antes de emitir luz puede sufrir una despolarización de la fluorescencia que disminuye la anisotropía de fluorescencia en estado estacionario. La despolarización depende de la vida media, del tipo de fluoróforo, del tamaño y forma de la biomolécula y de la viscosidad de su microambiente. APLICACIONES: BIOCATÁLISIS Y HOMO-FRET |
Espectroscopía de fluorescencia resuelta en el tiempo a través de un microscopio
En las dos últimas décadas, las técnicas de microscopía confocal de fluorescencia han evolucionado hasta convertirse en herramientas esenciales para estudiar complejos procesos celulares. Estos avances técnicos han abierto la puerta a los estudios de micro-espectroscopía de fluorescencia, es decir, la posibilidad de realizar estudios cuantitativos fotofísicos y espectroscópicos a través de un microscopio con alta resolución espacial (sub-μm), que puede extenderse incluso a estudios de molécula única.
MEDIDAS DE ESTADO ESTACIONARIO Y RESOLUCIÓN TEMPORAL CON EL MICRO-ESPECTRÓMETRO DE FLUORESCENCIA:
Las técnicas de micro-espectroscopía son óptimas para estudiar complejos procesos físico-químicos en células y tejidos vivos, ya que son mínimamente invasivas: en lugar de fijar y seccionar físicamente una muestra, es posible obtener un conjunto de datos 3D a partir de una muestra viva, a través de la sección óptica.
TIPOS DE MUESTRAS: IN VITRO O IN VIVO (EXTRACTOS CELULARES, CÉLULAS FIJADAS, CÉLULAS VIVAS, TEJIDOS)
Nuestro grupo dispone de un microscopio de fluorescencia multi-fotónico y confocal láser de barrido que nos permite hacer estudios de micro-espectroscopía de fluorescencia con excitación de 1 fotón (1PE) o 2 fotones (2PE).
 |
 |
|
|
Excitación multifotónica (2PE) como alternativa a la microscopía confocal (1PE): alta resolución espacial sin necesidad de pinhole
| MICROSCOPÍA CONFOCAL (1PE): la fluorescencia emitida por la muestra se filtra mediante un pinhole colocado frente al detector, de manera que sólo se registra la fluorescencia emitida por el plano focal. |
|
MICROSCOPÍA MULTIFOTÓNICA (2PE): absorción simultánea de dos fotones de la mitad de energía (típicamente rojo o infrarrojo). Para ello se necesita localizar una gran cantidad de fotones de excitación en un punto determinado de la muestra (volumen confocal ~ 0.1 mm3) un objetivo de alta apertura numérica durante un tiempo muy corto, utilizando láseres pulsados de ~100 fs en el infrarrojo IR - IR cercano. |
 |
|
DIFERENCIAS 1PE vs 2PE: en 2P sólo se excitan los fluoróforos localizados en el foco: se minimiza el daño por la luz en las muestras y permite estudiarlas a profundidades mayores, mejorando la resolución de un microscopio confocal. FOTOTOXICIDAD GLOBAL REDUCIDA DE LA MUESTRA vs mayor FOTOBLANQUEO EN EL VOLUMEN CONFOCAL El micro-espectrofotómetro puede utilizar excitación 1PE o 2PE: la elección del tipo de excitación depende del tipo de muestra y de la fotofísica y concentración de fluoróforos. 2PE es menos sensible a la dispersión que 1PE, produciendo imágenes de mayor resolución y contraste. Además, permite tiempos de observación más largos para los estudios con célula viva, pero produce mayor fotoblanqueo y fototoxicidad en muestras delgadas con un bajo número de fluoróforos. En estos casos, 1PE funciona bien, ofreciendo una mejor resolución espacial. |
-
Materiales híbridos: materia activa accionada mediante polímeros vivos biológicos:
-
Interacción de compuestos bioactivos en célula viva:
Nuestro grupo lleva colaborando con la empresa farmacéutica PHARMA MAR desde el año 2010, a través de un contrato de investigación que tiene por objeto desarrollar investigaciones en el campo de identificación del mecanismo de acción de agentes antitumorales. PHARMA MAR es una compañía especializada en la investigación, producción y comercialización de toda clase de productos bioactivos de origen natural obtenidos mediante síntesis, para su aplicación en medicina. El contrato de investigación formalizado con PHARMA MAR está destinado a la realización del proyecto de investigación de título "Estudio de las interacciones con la membrana celular de Irvalec y Aplidina; caracterización de su implicación en la respuesta a los compuestos".
Hasta ahora hemos trabajado con los agentes antitumorales Irvalec (IR) y Aplidina (APL). Usando derivados fluorescentes de IR, hemos encontrado que este compuesto interacciona rápidamente con la membrana plasmática de las células tumorales, promoviendo una reestructuración de la bicapa lipídica. Experimentos de FLIM-FRET han demostrado que las moléculas de IR se asocian formando estructuras supramoleculares que provocan la muerte celular por necrosis a través de la destrucción de la integridad de la membrana celular. Con respecto a Aplidina, hemos demostrado la interacción específica de APL con las isoformas del factor de elongación eEF1A1 y eEF1A2 por el método de FLIM-FRET-phasor in vitro, y en células sensibles y resistentes a Aplidina, HeLa-WT y HeLa-APL-R, utilizando un análogo fluorescente de Aplidina (APL-dmac). Se han detectado al menos tres especies moleculares en células vivas que contienen APL en diferentes microentornos, utilizando el método FLIM-phasor.
Para el futuro, nos proponemos caracterizar las distintas especies moleculares asociadas a la interacción de Aplidina con células HeLa-WT y HeLa-APL-R, sobre todo a nivel de la membrana plasmática. Para ello diseñaremos protocolos de marcaje, análisis e interpretación de los cambios observados en las imágenes de anisotropía de fluorescencia, FLIM-phasor y de polarización generalizada GP, asociados a cambios en la población de las especies moleculares de APL en la membrana plasmática. Además, dado que las propiedades/composición química de la membrana plasmática pueden variar dependiendo del tipo de células y de las características de la superficie a las que están adheridas las células vs las mismas células en suspensión, nos proponemos estudiar cómo pueden afectar estos cambios a la población de la/las especies moleculares de APL en la membrana.
-
Estudios de la membrana plasmática en célula viva:
Detección de dominios, dinámica y organización de los componentes lipídicos de las membranas celulares
La presencia de micro-dominios lipídicos ordenados y desordenados, en la membrana plasmática de células HeLa, se ha cuantificado utilizando imágenes de anisotropía de fluorescencia y sondas lipofílicas fluorescentes. El método utilizado está basado en que la movilidad rotacional de las sondas fluorescentes es sensible a cambios en la composición/ organización de los lípidos (en la figura de la izquierda se muestra la disminución con el tiempo del orden promedio de los lípidos en un fragmento de la membrana plasmática de una célula HeLa tratada con un compuesto antitumoral). Estos estudios se complementan con imágenes de polarización generalizada (GP) de sondas de membrana como el Laurdan (figura de la derecha), cuyas propiedades fotofísicas varían con el orden y la fluidez de la membrana.
|
|
|
|
| Variación con el tiempo del grado de orden lipídico (mínimo 0-máximo 1) de un fragmento de la membrana plasmática de una célula HeLa marcada con la sonda fluorescente TMA-DPH y tratada con un compuesto antitumoral que interacciona con un componente de la membrana celular. λexc=750 nm (82 MHz); λem=483/32 nm; T=37ºC. | Imagen de polarización generalizada (GP) de una célula HeLa marcada con la sonda lipofílica Laurdan. λexc=750 nm; λem=435/40 y 483/32 nm. T=34ºC. En la membrana plasmática se observa la coexistencia de dominios ordenados y desordenados. Al aumentar el orden lipídico, disminuye el número de moléculas de H2O en el microentorno del Laurdan, lo que da lugar a un aumento en la GP. |
-
Fotofísica:
Fotofísica fundamental.
En este período se concluyó la construcción del primer modelo mecanocuántico que describe correctamente el proceso de transferencia electrónica triplete-triplete en disolución (Zapata et al. 2014, J. Chem. Phys.), en colaboración con los Drs. O. Castaño, J.M. Frutos y colaboradores, del Depto. de Química-Física de la Univ. de Alcalá de Henares. El modelo permite analizar la transferencia en función de parámetros estructurales y energéticos de las especies excitadas participantes. Asimismo, también en colaboración con el grupo citado, se completó un detallado estudio “ab initio”, a nivel TD-DFT, HSE06-6311++G(d,p), de energías y conformación de los estados fundamental y excitado (S y T) de moléculas emisivas, sintetizadas en nuestros laboratorios, que presentan un comportamiento binario (0-1) de la intensidad de fluorescencia en función del pH (Acuña et al. 2013, Phys.Chem.Chem.Phys.). Finalmente, en colaboración con miembros de la Comisión de Fotoquímica de IUPAC, se completó un documento de referencia sobre la medida de anisotropía de fluorescencia en estado estacionario y con resolución temporal (Ameloot et al. 2013, Pure Appl. Chem.).
Diseño, síntesis, caracterización y aplicaciones de sondas moleculares y fármacos fluorescentes.
A lo largo de este período se pusieron a punto nuevos métodos de marcado fluorescente de los neurotransmisores dopamina y norefedrina, y del aminoácido neuroprecursor DOPA. Estos métodos son aplicables, además, al marcado de antioxidantes como hidroxitirosol y ácido salviánico. Asimismo, se estudió el comportamiento biofísico de varios fármacos fluorescentes de naturaleza lipídica (alquilfosfocolinas y lisofosfatidilcolinas) con actividad antitumoral ó antiparasitaria, previamente sintetizados en nuestros laboratorios. Algunos de estos análogos se utilizaron con éxito en la investigación del mecanismo de acción terapéutica, a nivel molecular, del correspondiente fármaco original.