Nuestro grupo dispone de un microscopio de fluorescencia multi-fotónico y confocal láser de barrido que nos permite hacer estudios de micro-espectroscopía de fluorescencia con excitación de 1 fotón (1PE) o 2 fotones (2PE).
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Excitación multifotónica (2PE) como alternativa a la microscopía confocal (1PE): alta resolución espacial sin necesidad de pinhole
| MICROSCOPÍA CONFOCAL (1PE): la fluorescencia emitida por la muestra se filtra mediante un pinhole colocado frente al detector, de manera que sólo se registra la fluorescencia emitida por el plano focal. |
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MICROSCOPÍA MULTIFOTÓNICA (2PE): absorción simultánea de dos fotones de la mitad de energía (típicamente rojo o infrarrojo). Para ello se necesita localizar una gran cantidad de fotones de excitación en un punto determinado de la muestra (volumen confocal ~ 0.1 mm3) un objetivo de alta apertura numérica durante un tiempo muy corto, utilizando láseres pulsados de ~100 fs en el infrarrojo IR - IR cercano. |
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DIFERENCIAS 1PE vs 2PE: en 2P sólo se excitan los fluoróforos localizados en el foco: se minimiza el daño por la luz en las muestras y permite estudiarlas a profundidades mayores, mejorando la resolución de un microscopio confocal. FOTOTOXICIDAD GLOBAL REDUCIDA DE LA MUESTRA vs mayor FOTOBLANQUEO EN EL VOLUMEN CONFOCAL El micro-espectrofotómetro puede utilizar excitación 1PE o 2PE: la elección del tipo de excitación depende del tipo de muestra y de la fotofísica y concentración de fluoróforos. 2PE es menos sensible a la dispersión que 1PE, produciendo imágenes de mayor resolución y contraste. Además, permite tiempos de observación más largos para los estudios con célula viva, pero produce mayor fotoblanqueo y fototoxicidad en muestras delgadas con un bajo número de fluoróforos. En estos casos, 1PE funciona bien, ofreciendo una mejor resolución espacial. |