Identificación de dianas de compuestos antitumorales en la membrana plasmática y en el interior celular

Contrato de colaboración para I+D PharmaMar. Estudio de las interacciones de Aplidin® en célula viva.

Utilizando métodos de análisis de imágenes de vidas medias de fluorescencia (FLIM) y de análisis de fasores (FLIM-fasor), hemos detectado tres especies moleculares relevantes en el mecanismo de acción del compuesto antitumoral Aplidin®, que se localizan en la membrana plasmática (especie A),  en la cara interior y/o regiones muy próximas a la membrana plasmática (especie B) y en el citoplasma (especie C) de células sensibles (HeLa wt) y resistentes (HeLa AplR), tratadas con el análogo fluorescente de Aplidin®, Apl-dmac.

Especies moleculares de Aplidin® detectadas a diferentes tiempos de interacción, utilizando la aproximación FLIM-fasor en célula viva. A tiempos cortos la especie A (naranja) se localiza en la membrana plasmática y se mantiene durante toda la interacción. La concentración de la especie C aumenta con el tiempo, y se representa en la imagen de fasores por los colores verde (baja concentración), azul claro y azul oscuro (alta concentración). λexc=750 nm (82 MHz); λem=520/35 nm; T=37ºC.

Utilizando métodos de transferencia de energía resonante FLIM-FRET y células HeLa wt y HeLa AplR, que expresan el factor de elongación marcado con la proteína fluorescente eEGFP (eEF1A1-EGFP o eEF1A2-EGFP), hemos detectado complejos Apl-dmac/eEF1A1-EGFP y Apl-dmac/eEF1A2-EGFP en la membrana plasmática  y en el interior celular, que coinciden con la distribución de las especies B y C respectivamente. A tiempos cortos se observa la presencia de complejos Apl-dmac/eEF1A-EGFP en la membrana plasmática y regiones próximas a su cara interior, que se distribuyen con el tiempo por todo el citoplasma y finalmente se acumulan en regiones bien definidas. Estos resultados han permitido identificar al factor de elongación eEF1A como diana del compuesto antitumoral.