Interacción de compuestos antitumorales con la membrana plasmática

Contrato de colaboración para I+D PharmaMar. Estudio de las interacciones de Irvalec® en célula viva.

Utilizando métodos de transferencia de energía resonante FLIM-FRET con análisis de fasores (FLIM-phasor), hemos estudiado la interacción del compuesto antitumoral Irvalec® con componentes de la membrana plasmática. En este estudio FRET hemos utilizado Irvalec marcado con OG-488 (Irv-OG488) como donador e Irvalec marcado con A-555 (Irv-A555) como aceptor.

En la imagen FLIM-FRET de células A549 tratadas con Irvalec podemos ver cómo la vida media del donador en la membrana disminuye por efecto de la presencia del aceptor, sugiriendo la existencia de FRET (figura de la izquierda, canal donador, I y II). Las moléculas de Irvalec se localizan en la membrana plasmática, suficientemente cerca como para sugerir que autoasocian, formando estructuras supramoleculares que probablemente inician la muerte celular por necrosis, a través de la ruptura de la membrana plasmática.

Imágenes FLIM-FRET de células A549 tratadas con 0.6 mM Irv-OG488, 1.8 mM Irv-A555 y 2.4 mM Irvalec. I (sección XY, Z = 0) y II (sección YZ, posición X definida por la flecha blanca de I): canal del donador (OG488). III (sección XY, Z = 0) y IV (sección YZ, posición X definida por la flecha blanca de III): canal del aceptor (A555). Filtro del canal del donador: FF01 520/35. Filtro del canal del aceptor: FF01 685/40. Dicróico: FF560-Di01. Escala tipo rainbow de vida media entre 1.5 y 3.5 ns. Barra de escala: 10 mm. Molina-Guijarro et al, PLoS ONE 2011, 6, e19042.		Estudio comparativo de la interacción de Irvalec con la membrana plasmática de células sensibles (HCT-116) y resistentes a Irvalec (HCT-116-Irv). Imágenes representativas de intensidad de fluorescencia (A, D, G), FLIM-phasor (B, E, H) y phasor plot (C, F, I). Fila 1: células HCT-116 sin tratar. Los phasores correspondientes a la autofluorescencia se marcan con un cursor gris en el phasor plot, de manera que los píxeles correspondientes a esos phasores aparecen en color gris en la imagen FLIM-phasor. Fila 2: células HCT-116-Irv tratadas con un total de 5 μM de Irvalec (Irv-OG488 200 nM, Irv-A555 800 nM, Irvalec 3 μM, 1:4:15). Los phasores correspondientes al donador (Irv-OG488) se marcan con un cursor verde en el phasor plot, de manera que los píxeles correspondientes a esos phasores aparecen en color verde en la imagen FLIM-phasor. Fila 3: células HCT-116 tratadas con un total de 4 μM de Irvalec (Irv-OG488 200 nM, Irv-A555 800 nM, Irvalec 3 μM, 1:4:15). Los phasores correspondientes al donador en presencia de aceptor (FRET) se marcan con un cursor rosa en el phasor plot, de manera que los píxeles correspondientes a esos phasores aparecen en color rosa en la imagen FLIM-phasor. λexc=755 nm (80 MHz); λem=520/35 nm; T=37ºC. Molina-Guijarro et al, PLoS ONE 2015, DOI:10.1371/journal.pone.0140782

El método de phasores es una herramienta que permite interpretar de forma directa la señal de intensidad de fluorescencia recogida en una imagen FLIM sin realizar ningún ajuste: el decaimiento de intensidad de fluorescencia de cada pixel se transforma en un punto con un par de coordenadas que se corresponden con la fase y el módulo de un vector, llamado phasor. Los phasores de todos los píxeles de una imagen dan lugar a un histograma bidimensional (phasor plot o diagrama de phasores) en el que cada pixel se corresponde con un punto (phasor) que tiene una posición única, y viceversa, cada phasor está asociado a un pixel de la imagen.

En la figura de la derecha se muestra el análisis de phasores del estudio de la interacción de Irvalec con la membrana plasmática en células sensibles (HCT-116) y resistentes a Irvalec (HCT-116-Irv). De forma gráfica, marcamos con cursores las posiciones de los phasores correspondientes a la autofluorescencia (cursor gris, fila 1) y donador en ausencia de aceptor (cursor verde, fila 2). Cualquier disminución de la vida media del donador debida a un aumento de la AF situaría el phasor correspondiente en algún punto de la línea que une las especies donador y AF, pero si la disminución se debe a FRET, el phasor aparecerá sobre una trayectoria circular que se desplaza hacia la derecha respecto de esta línea (cursor rosa). Este método nos permite ver el diferente comportamiento de las células sensibles y resistentes a Irvalec: en células resistentes (fila 2) podemos ver las moleculas de donador situadas en el exterior celular no afectadas por FRET (color verde), mientras que en las células sensibles (fila 3) podemos ver Irvalec en el interior celular (color verde) y en la membrana plasmática (color rosa). En esta última localización, los phasores correspondientes a Irvalec han sufrido una disminución de la vida media del donador debida a FRET.